В этом году Нобелевской премии в области физиологии и медицины удостоены американцы Уильям Кэлин и Грегг Семенза, а также британец Питер Рэтклифф. В 2016 году работы этих исследователей уже получили оценку в виде другой престижной награды — премии Альберта Ласкера, ежегодно присуждаемой в США за фундаментальные медицинские исследования. Согласно официальной формулировке Нобелевского комитета, лауреаты отмечены «за открытие механизмов, посредством которых клетки воспринимают доступность кислорода и адаптируются к ней».
Следует отметить, что в действительности речь идет не о любых клетках, а в первую очередь о клетках человека и животных. Пожалуй, отправным пунктом исследований в области адаптации к гипоксии можно считать период конца 60-х годов XX века, когда физиологи приступили к внимательному изучению реакций организма человека на подъем в горы или анемические состояния. Эти исследования привели к открытию эритропоэтина — гормона, который выделяется в кровь (преимущественно тканями почек, а также печени), причем продукция его резко возрастает в ответ на дефицит кислорода.
Распространяясь по организму, и достигая костного мозга, эритропоэтин стимулирует формирование эритроцитов, что обеспечивает значительное улучшение снабжения тканей кислородом уже в течение нескольких часов после начала гипоксии. Однако еще долгое время никто не знал, во-первых, как именно клетки «оценивают» количество кислорода, во-вторых, все ли клетки на это способны, и, в-третьих, какие механизмы лежат в основе реализации клеточного ответа. Именно за решение этих вопросов и была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине в этом году.
Исследования, которые получили высшую оценку Нобелевского комитета, были начаты на рубеже 80-х и 90-х годов XX века. Причем каждый из трех лауреатов пришел в эту область своим особым путем.
Питер Рэтклифф первоначально получил медицинское образование, затем перепрофилировался на молекулярную биологию. В конце 80-х его исследовательская работа была связана с изучением болезней почек, среди которых некоторую долю составляют патологии ишемической этиологии. Как уже было сказано, именно почки вырабатывают эритропоэтин в ответ на состояние гипоксии. В 1990 году Рэтклифф основал в Оксфорде лабораторию биологии гипоксии, которую возглавлял более 20 лет, поставив перед собой цель разобраться в механизмах регуляции экспрессии гена эритропоэтина.
Тематика работ Грегга Семензы до начала 90-х годов касалась заболеваний, обусловленных нарушениями эритропоэза, таких как талассемия. В 1992 году он выделил новый белок, связывающийся с регуляторным участком в гене эритропоэтина и обеспечивающий стимуляцию транскрипции данного гена при недостатке кислорода. Также, как и Рэтклифф, Семенза с этого момента практически полностью переключился на исследование молекулярных и клеточных механизмов адаптации организма к гипоксии.
Уильям Келин — специалист по опухолям, занимавшийся в конце 80-х — начале 90-х годов проблемой наследственного заболевания Гиппеля — Линдау. Этот синдром с аутосомно-доминантным наследованием выражается в повышенном риске возникновения рака (чаще всего образуются опухоли головного или спинного мозга, сетчатки, почек). В 1988 году было установлено, что причиной заболевания являются мутации в гене VHL (аббревиатура, образованная от англоязычного названия заболевания, von Hippel — Lindau disease). И, как выяснилось впоследствии, белок, кодируемый этим геном, является еще одним из ключевых игроков в ответе клеток на вариации в концентрации кислорода в среде.
Любопытно отметить, что в первое время статьи из всех трех лабораторий выходили одна за другой, и нередко практически одновременно исследователи параллельно публиковали полученные результаты, описывающие одни и те же детали механизма. Впрочем, десятилетие спустя у них начали появляться и совместные публикации.
Механизм клеточного ответа на гипоксию
Первоначальной моделью для изучения механизма реакции клеток на гипоксию стала регуляция гена эритропоэтина в клетках почек или печени. За десяток лет выяснились основные этапы этой регуляции, общая схема которой приведена на рис. 2.
Первоначально в 1991 году Рэтклифф с коллегами обнаружил около 3′-концевого участка гена эритропоэтина регуляторный участок (энхансер), присутствие которого определяет способность гена повышать уровень экспрессии при дефиците кислорода (C. W. Pugh et al., 1991. Functional analysis of an oxygen-regulated transcriptional enhancer lying 3′ to the mouse erythropoietin gene). Годом позже в лаборатории, где работал Грегг Семенза был выделен и исследован транскрипционный фактор, связывающийся с ДНК в этой области, — он получил название HIF (G. L. Semenza, G. L. Wang, 1992. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation). Этот белок формируется из двух субъединиц: одна из них обозначается как HIFα, другая — HIFβ. Вскоре было установлено, что HIF работает не только в почках и печени, но и во всех прочих типах клеток организма, а его мишенями, помимо гена эритропоэтина, оказались еще нескольких сотен других генов, тем или иным образом участвующих в адаптации клеток и организма к дефициту кислорода (G. L. Wang, G. L. Semenza, 1993. General involvement of hypoxia-inducible factor 1 in transcriptional response to hypoxia).
Здесь можно отметить, что у человека и других позвоночных обе субъединицы фактора HIF представлены семействами, включающими по 3 паралогичных гена, которые работают в разных типах клеток и регулируют разные наборы генов. Причем белковый продукт гена HIF3α, по-видимому, является ингибитором по отношению к продукту гена HIF1α. Тонкости функциональных особенностей всех паралогов все еще не до конца изучены.
Количество мРНК и белка HIFβ в клетках относительно постоянно, оно не зависит от концентрации кислорода, а вот субъединица HIFα является регулируемой. Во-первых, ее количество в клетке держится на низком уровне при нормальном уровне кислорода, но резко возрастает при гипоксии. Во-вторых, при гипоксии он обнаруживается исключительно в ядре, а при нормальном уровне кислорода — преимущественно в цитоплазме, что обеспечивается взаимодействием белка с вспомогательными белками системы переноса белков между ядром и цитоплазмой.
Исследования Кэлина позволили выяснить, что количество белка HIFα регулируется посредством протеолиза — разрушения при помощи протеасом (M. Ivan et al., 2001. HIFα Targeted for VHL-Mediated Destruction by Proline Hydroxylation: Implications for O2 Sensing). Протеасомы узнают белки-мишени по пришитым убиквитиновым меткам. В случае HIFα убиквитинирование осуществляется при участии того самого белка VHL, который уже упоминался выше. Ген, кодирующий белок VHL, входит в число наиважнейших генов-супрессоров опухолей. И это, по-видимому, напрямую связано с его ролью в регуляции HIF (как минимум отчасти).
Позднее были установлены новые подробности. Оказалось, что для взаимодействия с VHL требуется появление гидроксильных групп (-OH) на двух остатках пролина в молекуле HIFα. Гидроксилирование осуществляется ферментами PHD (Prolil hydroxylase), которые кодируются тремя паралогичными генами (PHD1,2,3). Эта реакция происходит при непосредственном участии молекулярного кислорода (O2), а также требует присутствия ионов железа и аскорбиновой кислоты. При недостатке какого-то из этих компонентов реакция гидроксилирования становится невозможной, что приводит к прекращению взаимодействия HIFα с VHL, и количество белка HIFα начинает расти.
Еще одной составляющей изученного механизма оказалось гидроксилирование по остатку аспарагина в молекуле HIFα, которое осуществляется (при тех же условиях, что и гидроксилирование по пролину) другим ферментом, названным FIH1 (Factor inhibiting HIF). Гидроксилирование остатка аспарагина препятствует взаимодействию HIFα с транскрипционным коактиватором (CBP или p300), без которого уровень активации транскрипции генов-мишеней оказывается заметно ниже.
Аспарагин-гидроксилаза и пролин-гидроксилазы имеют разный порог активации. Полномасштабный ответ на гипоксию развивается при парциальном давлении кислорода около 1% от нормы или ниже. При этой концентрации гидроксилазы абсолютно неактивны. По мере повышения концентрации кислорода после гипоксии первым активируется белок FIH-1, который гидроксилирует остатки аспарагина, приводя к частичному подавлению активаторной функции HIF, а при дальнейшем приближении концентрации кислорода к нормальному уровню становится активной и диоксигеназа PHD, гидроксилирующая остатки пролина, и концентрация HIFα начинает быстро снижаться (рис. 3).
Позже оказалось, что помимо убиквитинирования, VHL способен блокировать работу HIF еще и другим путем — привлекая к нему белки-репрессоры, препятствующие активации транскрипции генов-мишеней, как показано на рис. 4.
Достаточно быстро стало ясно, что реагировать на кислород могут абсолютно все клетки организма животных и человека, и механизм всегда принципиально один и тот же, различаются в определенной мере лишь наборы активирующихся генов. Регуляция с участием HIF затрагивает в сумме более трех сотен генов, функция которых заключается в обеспечении снабжения тканей кислородом, стимулировании регенеративных процессов и включении защитных механизмов внутри клеток, подвергшихся воздействию гипоксии (J. Schödel et al., 2011. High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq).
Например, одной из таких защитных реакций является повышение интенсивности реакций гликолиза (расщепления глюкозы до молочной кислоты в цитозоле клеток), как альтернативного пути наработки АТФ (в обычных условиях основная доля АТФ производится за счет кислородного дыхания, осуществляемого митохондриями). Также гипоксия стимулирует аутофагию, и одновременно подавляет некоторые особенно энергозатратные процессы. На уровне межтканевой регуляции происходит стимуляция не только эритропоэза, но и ангиогенеза (роста сосудов) — благодаря стимуляции синтеза и секреции фактора роста эндотелия сосудов VEGF, расширения капилляров, интенсивности вентиляции легких и целого ряда других физиологических процессов. В нервной ткани обнаружилась выраженная реакция на колебания снабжения мозга кислородом в клетках астроцитах. Оказалось, что выделяемый ими эритропоэтин не только участвует в активации эритропоэза, но и стимулирует миграцию нейробластов в область ишемического повреждения мозга, то есть регенерацию нервной ткани (J. C. Chavez et al., 2006. The Transcriptional Activator Hypoxia Inducible Factor 2 (HIF-2/EPAS-1) Regulates the Oxygen-Dependent Expression of Erythropoietin in Cortical Astrocytes).
Вся система реакций на уровне молекул, клеток и организма включает множественные взаимовлияния, как положительные, так и отрицательные, формирующие разнообразные обратные связи (рис. 5). Весьма примечательно, что в число генов, активируемых фактором HIF, входят гены ферментов гидроксилаз, которые в конечном итоге ограничивают реализацию ответа на гипоксию.
А при чрезмерно затянувшемся состоянии гипоксии к регуляции подключается p53 — еще один известный супрессор опухолей. В комплексе с белком Mdm2, он связывает HIFα, что приводит опять же к убиквитинированию и протеасомной деградации этого белка. К тому же белок p53 конкурирует c HIF за связывание коактиваторных белков CBP/p300.
В последние годы становится ясно, что HIF лишь один из игроков (хоть и очень весомый), определяющих способность клеток реагировать на изменения доступности кислорода. И все три ученых, удостоенных Нобелевской премии, как и сотни других исследователей по всему миру, продолжают активно развивать данную область. Не вдаваясь в эти новые подробности (о которых можно прочитать, к примеру, в статьях M. Ivan, W. G. Kaelin, 2017. The EGLN-HIF O2-Sensing System: Multiple Inputs and Feedbacks, A. A. Chakraborty et al., 2019. Histone demethylase KDM6A directly senses oxygen to control chromatin and cell fate и C. W. Pugh, P. J. Ratcliffe, 2017. New horizons in hypoxia signaling pathways), обратимся к практической стороне вопроса.
Гипоксия, HIF и медицинская практика
Все многоклеточные организмы, а животные в особенности, чрезвычайно зависимы от кислорода. Этот элемент совершенно необходим нам для дыхания — процесса, который обеспечивает производство в митохондриях молекул АТФ, используемых практически во всех процессах жизнедеятельности клеток. Неудивительно, что целый ряд медицинских проблем связан именно с нарушениями снабжения тканей кислородом и ответом на это состояние. Это определяет тесную связь фундаментальной составляющей сделанных открытий с медицинской практикой.
Во-первых, потенциальное практическое применение связано с проблемой адаптации организма к каким-то специфическим условиям, где по той или иной причине возникает более или менее длительная кислородная недостаточность — подъем на высоту, подводные погружения и т. д. Во-вторых, — с лечением нарушений в тканях, обусловленных ишемическими состояниями, к примеру, из-за атеросклеротических изменений сосудов, гипертонии, заболеваний дыхательных путей или анемии. В-третьих, — с воспалительными процессами, включая, в частности, заживление ран и отторжение трансплантатов. В-четвертых, оно связано с проблемой возрастных изменений, которые могут выражаться в неспособности организма в полной мере реализовать необходимый адаптивный ответ на гипоксию тканей.
Все вышеупомянутые проблемы могут иметь решение в виде дополнительной активации ответа организма на гипоксию. Для этого разрабатываются препараты, ингибирующие белки гидроксилазы и VHL.
С другой стороны, HIF очень часто бывает гиперактивирован в опухолевой ткани. Эта повышенная активность бывает обусловлена как фактическим недостатком доступа кислорода к клеткам опухоли вследствие очень быстрого ее роста, так и мутациями в гене белка HIFα или его регуляторов. В этом случае потенциально возможным решением является, напротив, применение подавителей ответа на гипоксию, которые препятствуют интенсивному ангиогенезу в опухолевой ткани и тем самым замедляют рост и понижают агрессивность раковой опухоли. Некоторые синтетические препараты, прямо или косвенно подавляющие HIF (например, сердечный гликозид дигоксин), в настоящее время проходят клинические испытания для лечении нескольких форм рака.
О проонкогенном влиянии избыточной активации HIF, конечно, следует помнить, разрабатывая стратегии решения проблем гипоксии, упомянутые чуть выше. Гиперактивация ответа на гипоксию может иметь и другие негативные последствия.
Наконец, нельзя не сказать о том, что система ответа на концентрацию кислорода оказывается критически важной не только в каких-то специфических условиях среды или при патологии тканей, но и в ходе нормального эмбрионального развития. HIF участвует в росте, дифференцировке, контроле апоптоза клеток многих тканей, включая сердечно-сосудистую, скелетогенную и иммунную системы. Эксперименты на животных показали, что эмбрион, лишенный функционального фактора HIF, очень рано погибает вследствие нарушения процессов формирования кровеносной системы по мере роста зародыша и невозможности нормального развития организма.
Татьяна Романовская
