Российские ученые разработали новую одноэтапную тест-систему для выявления SARS-CoV-2, вызвавшего пандемию COVID-19. За счет дополнительных контролей такой подход снижает вероятность ложноположительных результатов при загрязнении образцов. Эксперименты показали, что новая тест-система чувствительнее той, что была одобрена ВОЗ еще в феврале 2020 года, и позволяет эффективно определять больных со слабовыраженными симптомами. Результаты исследования представлены в Journal of Medical Virology.

Распространение COVID-19 началось в конце 2019 года, 11 марта 2020 года ВОЗ признало бедствие пандемией, которая и по сей день остается в новостном топе. Уже разработаны методы выявления вируса, однако не всегда они оказываются достаточно эффективными. В случае ложного обнаружения вируса человек будет вынужден оставаться на карантине с регулярными проверками через приложение, которое не лишено багов — можно получить штраф просто так. Его «контактерам» тоже придется сдавать анализы и сидеть на карантине. Обратная ситуация — у действительно больного человека вирус не находят — не столько обидная, сколько опасная, ведь он будет болеть сам и заражать окружающих.

Ученые из Санкт-Петербурга и Москвы придумали одноэтапный способ выявления SARS-CoV-2. Он основан на количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с обратной транскрипцией — это самый применяемый при диагностике этого возбудителя метод. Поскольку наследственная информация коронавируса представлена РНК, ее переводят в ДНК, а затем используют в реакции. Этапы обычные: разделение двух цепей ДНК, присоединение к ним специфических праймеров, на концах которых происходит удлинение новообразованной цепи. Для количественного определения авторы также добавляли флуоресцентные ДНК-зонды, связывающиеся с определенными последовательностями. В качестве целевого участка был выбран тот, что соответствовал константной, то есть постоянной для вируса, области гена РНК-зависимой РНК-полимеразы. Этот фермент катализирует синтез РНК на РНК-матрице. В других тестах часто берут две мишени: одна последовательность характерна для всех коронавирусов, а вторая только для SARS-CoV-2. Однако в таком случае возможен эффект перекрестной реактивности, то есть тест даст положительный результат на другие коронавирусы.

«Особенностью новой системы стали контроли основных этапов проведения анализа, то есть выделения нуклеиновых кислот из образцов и прохождения ПЦР. Один тип основан на использовании, по сути, псевдовирусных частиц, представляющих собой фрагменты поверхностного белка фага MS-2, внутри которого находится РНК целевого участка SARS-CoV-2. Второй тип контролей — ДНК-плазмиды с тем же участком, но в форме ДНК. Особая схема проведения тестов позволяет выявить загрязнение отрицательных образцов положительными — такое бывает, поскольку обычно материал анализируется скопом», — говорит Екатерина Гончарова, сотрудница группы молекулярной генетики патогенных микроорганизмов НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, соавтор работы.

Для исследования аналитической специфичности авторы использовали панель вирусных ДНК и РНК, которые вызывают ОРВИ, среди них — четыре коронавируса, но без SARS-CoV-2. Результаты для всех оказались отрицательными, то есть не было эффекта перекрестной реактивности. Чтобы определить чувствительность системы, авторы строили стандартную кривую: делали десятикратные разведения MS-2 фагов с целевыми участками, ставили ПЦ в реальном времени и считали, какие количества тест сможет обнаружить. Чувствительность составила 103 копии РНК в миллилитре, что соответствует международным стандартам.

Наконец, тест-систему испытали при анализе смывов с носоглотки людей, которые болели коронавирусом в легкой и средней форме. Авторы сравнивали свои результаты с полученными по протоколу, одобренному ВОЗ. Оказалось, что из 109 образцов все были положительными, однако система ВОЗ определила 9 смывов как отрицательные. «Третейским судьей» стал еще один отечественный тест. И он тоже показал положительный результат. Вероятно, это можно объяснить тем, что система ВОЗ разрабатывалась еще в начале эпидемии на основе недостаточной базы данных.